横紋筋肉腫が疑われた場合、まず、血液検査、尿検査、画像検査、骨髄検査などで全身を調べます。
また、傍髄膜（鼻咽頭、鼻腔、副鼻腔、中耳など、頭の骨の底にあたる頭蓋底に隣接する部位）に腫瘍があることが疑われる場合には、髄液検査も行います。
これらの検査結果に基づいて、どこにどれくらいの大きさの腫瘍があるかを確認し、治療前ステージ（病期）分類を行います。その後、手術による腫瘍切除（または生検）で採取した腫瘍細胞を顕微鏡で調べる病理検査を行って、横紋筋肉腫かどうかを診断します。
１．画像検査
腫瘍の場所や大きさ、広がりなどを確認するためにCT検査、MRI検査、超音波（エコー）検査、PET-CT検査、骨シンチグラフィなどの画像検査（画像診断）を行います。
中でも、PET-CT検査は、腫瘍の活動状態（腫瘍が活発かどうか）を調べることができ、転移している場所を知るのに有用です。そのため、治療を開始する前のステージ（病期）の診断のために実施することもあります。
２．骨髄穿刺検査
骨髄は血液をつくる組織で、全身の骨の中にあります。骨髄穿刺検査（骨髄検査）は、治療を始める前に行う検査です。通常はうつ伏せや横向きの状態で、腰の骨に専用の針を刺し、骨髄液を注射器で吸引して採取します。採取した骨髄液は顕微鏡で詳しく調べ、腫瘍細胞の有無などを確認します。針を刺すときや骨髄液を吸い取るときに痛みを伴うため、事前に局所麻酔を行います。また、小児の場合は、必要に応じて全身麻酔あるいは鎮静薬を使用し、苦痛や不安を和らげながら検査を行います。
３．病理検査（生検）
腫瘍の一部分を切り取って、顕微鏡で詳しく調べる検査を「生検」といいます。
生検は、原則として治療を始める前に行いますが、1回の手術で腫瘍をすべて取りきれるような場合は、手術後の組織を用いて検査を行います。
生検では、病理医と呼ばれる専門の医師が組織や細胞の性質を詳しく調べます（病理検査）。これにより、腫瘍が悪性か良性か、また、がんの悪性度（治りにくさ）や詳しい種類を診断します。一部の横紋筋肉腫では、腫瘍組織に特徴的にみられる遺伝子の変化を調べて診断を確定することもあります。
また、腫瘍の周囲や、遠くのリンパ節への転移を調べるために、リンパ節の組織を採取することもあります。
採取の方法は、皮膚を少し切り開いて1cm角程度の腫瘍組織を直接採取する開放生検が一般的です。ただし、体への負担や安全性を考えて、少し太めの針を刺して組織を採取する針生検（コア針生検）を行うこともあります。いずれの方法でも、その後の治療に影響が出ないよう、組織を採取する場所や針を刺す位置などを慎重に検討して行います。
４．腫瘍マーカー検査
横紋筋肉腫では、現在のところ、診断や治療効果の判定に使用できるような特定の腫瘍マーカーはありません。