横紋筋肉腫が疑われた場合、まず、血液検査、尿検査、画像検査、骨髄検査などで全身を調べます。また、傍髄膜（鼻咽頭、鼻腔、副鼻腔、中耳などの頭蓋底付近）に腫瘍があることが疑われる場合には、髄液検査も行われます。
これらの検査結果に基づいて、病期（ステージ）分類を行った後、腫瘍の切除または生検を行い、切り取った腫瘍細胞を顕微鏡で見て、横紋筋肉腫かどうかを診断（病理検査）します。
１．画像診断
腫瘍の場所や大きさ、広がりなどを確認するためにCT検査、MRI検査、PET/CT検査、タリウムシンチグラフィ、骨シンチグラフィなどの画像診断を行います。
中でも、PET/CT検査は、腫瘍の活動状態（腫瘍が活発かどうか）を調べることができ、転移している場所を知るのに有用です。そのため、治療を開始する前の病期（ステージ）の診断のために実施されることもあります。
２．骨髄穿刺検査
骨髄は血をつくっている場所で、全身の骨の中にあります。骨髄穿刺検査（骨髄検査）は、治療を開始する前に行われる検査で、通常は腸骨（腰の骨）に骨髄針を刺し、骨髄液を注射器で吸引して採取します。採取した骨髄を顕微鏡で観察し、腫瘍細胞の有無などを調べます。強い痛みを伴う検査のため、全身麻酔あるいは鎮静薬を使用して行われることが多くなっています。
３．病理診断
腫瘍の一部分を採取して、その組織を顕微鏡で詳しく調べる検査を「生検」といいます。横紋筋肉腫では、生検の結果によって治療方針が決まる重要な検査です。生検では、悪性腫瘍かどうか、病気の細かい種類（悪性度）などについて、病理医が組織や細胞の性質を詳しく調べ、病理診断（病理検査）を行います。一部の横紋筋肉腫では、腫瘍組織に特徴的に見られる遺伝子変異が診断の助けになることがあります。
腫瘍の周囲や遠隔のリンパ節に転移が疑われるときは、疑わしいリンパ節を採取して調べる場合もあります。
手術の詳細は後述しますが、最初の手術（腫瘍切除）で腫瘍を全部取りきれると判断される場合以外は、この生検がすべての治療に先立って行われます。
針生検や吸引生検では、組織の構築が壊れて横紋筋肉腫の正確な病理診断ができない場合があります。また、必要な遺伝子診断のために十分な検体を採取できない場合もあります。そこで、診断のために必要な組織を十分に採取するために、通常は、開放生検（腫瘍がある部分を切り開いて1cm角程度の腫瘍組織を採取する検査）が行われます。